紫外分光光度法測(cè)蛋白酶酶活力

美析儀器有限公司

關(guān)鍵詞：紫外分光光度法；蛋白酶；美析儀器；UV-1700紫外分光光度計(jì)

1、原理 

蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪素底物，然后加入三lu.yi.suan終止酶反應(yīng)，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對(duì)紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測(cè)定。根據(jù)吸光度計(jì)算其酶活力。酶活單位的定義：每1mL粗酶液，在一定溫度和pH值條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以（u/mL）表示。

2、試劑和溶液 

2.1  三lu.yi.suanc（CCL3·COOH）=0.4mol/L 稱取三lu.yi.suan65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2.2  氫氧化鈉溶液c（NaOH）=0.5mol/L 按GB601配制。 

2.3  鹽酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 

1 mol/L HＣＬ:取90mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HＣＬ：取9mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至1000mL。 

2.4  緩沖溶液 

a、磷酸緩沖液（pH＝7.5）適用于中性蛋白酶 

稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氫鈉（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 

b、乳酸緩沖液（pH＝3.0）適用于酸性蛋白酶 

甲液  稱取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液  稱取乳酸鈉（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 

使用溶液  取甲液8 mL，加乙液1 mL，混勻，稀釋一倍，即成0.05moi/L乳酸緩沖溶液。 

c、硼酸緩沖溶液（pH＝10.5）適用于堿性蛋白酶 

甲液  稱取硼酸鈉（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液  稱取氫氧化鈉4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 

使用溶液  取甲液500 mL、乙液400 mL混勻，用水稀釋至1000mL。 上述各種緩沖溶液，均須用pH計(jì)校正。 

2.5  10g/L酪素溶液稱取酪素1.000g，至0.001g，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液（若酸性蛋白酶則用濃乳酸2～3滴）濕潤(rùn)后，加入適量的各種適宜pH的緩沖溶液約80 mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直到*溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的ｐH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。 

2.6 100ug/mL L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 

a、稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，至0.0002g，用1mol/L鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL，即為1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。 

b、吸取1mg/ mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00 mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液在冰箱內(nèi)貯存或立即使用。 

3  儀器和設(shè)備 

3.1  恒溫水浴40±0.2℃。 

3.2  美析紫外分光光度計(jì)UV-1700。 

4  分析步驟 

4.1  求K值 

按下表配制不同濃度的L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后，直接用紫外分光光度計(jì)于275nm測(cè)定其吸光度（A），以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（此線應(yīng)通過(guò)零點(diǎn)）, 根據(jù)作圖或用回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數(shù)K值;（其K值應(yīng)在（130～135）范圍內(nèi)）。 管  號(hào) 

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃

度 （μg/mL） 

取100ug/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 

mL 

取水的體積 

mL 

吸光值 Abs. 0 0 0 10  1 10 1 9  2 20 2 8  3 30 3 7  4 40 4 6  5 50 

5 

5 

4.2 測(cè)定 

吸取適量稀釋的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三lu.yi.suan4.00 mL，其它操作條件同福林法測(cè)定中的反應(yīng)、靜止沉淀，直到過(guò)濾。濾液用紫外分光光度計(jì)，在275nm波長(zhǎng)下，用10mm比色皿，測(cè)定其吸光度（A）。 

a、先將酷素溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min； 

b、按下列程序操作： 

 試管A（空白）試管B（酶試樣，需作三個(gè)平行試樣） 加酶液2.00 mL 加酶液2.00 mL 40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min 

加三lu.yi.suan4.00 mL（搖勻）加酪素2.00mL(已預(yù)熱)（搖勻） 40±0.2℃，10min（計(jì)時(shí)）40±0.2℃，10min（計(jì)時(shí)） 加酪素2.00mL(已預(yù)熱)（搖勻）加三lu.yi.suan4.00mL（搖勻） 繼續(xù)加熱10min，過(guò)濾或離心繼續(xù)加熱10min，過(guò)濾或離心 于275nm波長(zhǎng)，測(cè)上清液吸光值于275nm波長(zhǎng)，測(cè)上清液吸光值 

c、1.398和166蛋白酶，除反應(yīng)與顯色溫度為30±0.2℃外，其它操作同 4.2。標(biāo)準(zhǔn)曲線作同樣處理。 

5  計(jì)算 

在40℃下每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸,定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。 

X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E 

式中：X——樣品的酶活力，(u/mL)； 

      A——試樣溶液的平均吸光度；       K——吸光常數(shù)； 

      8——反應(yīng)試劑的總體積，mL；       2——吸取酶液2.00mL； 

      1/10——反應(yīng)時(shí)間10min，以1min計(jì)；       n——稀釋倍數(shù) 

      E——紫外法與福林法的換算系數(shù)（中性、堿性蛋白酶系數(shù)為0.50；酸性蛋白酶系數(shù)

為0.77）。 

所得結(jié)果表示至整數(shù)。 6 結(jié)果的允許差 

平行試驗(yàn)測(cè)定值之差不得超過(guò)3％。